熒光原位雜交(FISH)

熒光原位雜交 (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) 是指利用熒光染料標(biāo)記的，已知序列的單鏈核酸作為探針，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與待檢樣品中核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，然后通過(guò)觀察熒光信號(hào)，從而對(duì)樣品中待檢核酸進(jìn)行定性，定量及定位分析。FISH 具有快速，信號(hào)強(qiáng)，特異性高以及可以多重染色等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，基因組結(jié)構(gòu)分析等領(lǐng)域。

影響FISH 結(jié)果的因素有很多，包括樣品準(zhǔn)備和處理，顯微鏡，光源，熒光探針以及濾光片。FISH 通常基于熒光顯微鏡來(lái)觀測(cè)信號(hào)，所用濾光片包括激發(fā)片，二向色鏡和發(fā)射片三種。其工作原理如下圖所示:

l                      激發(fā)片：選擇透過(guò)光源某部分波段的光，用來(lái)激發(fā)熒光探針；

l                      二向色鏡：反射光源的光至樣品，透過(guò)產(chǎn)生的熒光并反射激發(fā)光的散射光；

l                      發(fā)射片：選擇透過(guò)熒光的某部分波段的光至檢測(cè)器或人眼，并可以阻擋掉激發(fā)光的雜散光。

在 FISH 實(shí)驗(yàn)中，濾光片帶寬的大小會(huì)對(duì) FISH 圖像的對(duì)比度產(chǎn)生重要的影響。增加帶寬會(huì)提高激發(fā)和接收效率，使接收的信號(hào)增強(qiáng)。但實(shí)際接收的信號(hào)中同時(shí)包含了探針的熒光信號(hào)和樣品的背底噪音，帶寬的增加會(huì)同時(shí)增加這兩者的強(qiáng)度。帶寬減小，雖然可以降低背底噪音的強(qiáng)度，但熒光信號(hào)也會(huì)隨之減弱 。所以對(duì)于對(duì)比度要求很高的FISH 實(shí)驗(yàn)，針對(duì)于每種具體的染料，都會(huì)存在一個(gè)*的帶寬，使 FISH 圖像能夠達(dá)到*的對(duì)比度。FISH 濾光片的帶寬都是根據(jù)常用的 FISH 染料做過(guò)優(yōu)化，可以為用戶(hù)的 FISH 實(shí)驗(yàn)提供*的圖像對(duì)比度。

"B" 的信號(hào)比"A" 多91%, 但是“B" 的噪音比“A" 多226%。“A"具有更好的對(duì)比度！

FISH 濾光片組具有以下特點(diǎn) :

l                      高透過(guò)率、高截止深度和高光譜陡度；

l                      保證足夠亮度的同時(shí)，提供*的圖像對(duì)比度；

l                      消除串色的影響；

a. 消除Gold 和Aqua 串色到Green 通道；

b. 消除Gold 和Orange 串色到Red 通道；

l                      對(duì)多波段濾光片組中的DAPI 通道進(jìn)行特殊處理，避免DAPI 信號(hào)過(guò)強(qiáng)而將其他通道信號(hào)掩蓋；

l                      多色圖像疊加零漂移；

l                      磁控濺射鍍膜，終身質(zhì)保。

ET 系列 - FISH 單波段帶通濾光片組

ET 系列 - FISH 多波段濾光片組

DAPI 是一種能夠與DNA雙鏈特異性結(jié)合的有機(jī)熒光染料。在 FISH 實(shí)驗(yàn)中，DAPI 主要用來(lái)對(duì)整個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行染色成像，這就導(dǎo)致了 DAPI 的濃度要遠(yuǎn)高于其他 FISH 探針的濃度。而在有些 FISH 實(shí)驗(yàn)流程中，DAPI 是在最后一步進(jìn)行染色，染色之后也沒(méi)有清洗的步驟。

在使用多波段濾光片進(jìn)行多色 FISH 實(shí)驗(yàn)中，為了避免DAPI 的信號(hào)將其他 FISH 探針的信號(hào)掩蓋，在 多波段濾光片組中，會(huì)刻意降低激發(fā)片在 DAPI 處的透過(guò)率，從保證 DAPI 的信號(hào)不至于過(guò)高（見(jiàn)下圖）。

DAPI 和 Aqua 的發(fā)射峰高度重疊，通常情況下同時(shí)做兩種探針的成像會(huì)很困難，因?yàn)榇罅康?/span> DAPI 信號(hào)會(huì)將 Aqua 信號(hào)掩蓋掉。

69014 濾光片組，通過(guò)降低 DAPI 的激發(fā)效率，能夠?qū)崿F(xiàn)DAPI，Aqua，Green 和 Orange 四色的同時(shí)觀察。 DAPI 和Aqua 采用不同的激發(fā)波段，但共享同一個(gè)接收通道（見(jiàn)下圖）。

ET 系列 - FISH 多波段濾光片組

1. 為保證 Green 和 Orange 強(qiáng)度接近，59011 適用于汞燈和鹵素?zé)艄庠矗?/span>59012 適用于 LED 光源；

2. 含一個(gè)雙波段激發(fā)片，用于同時(shí)激發(fā) Green 和 Orange；一個(gè)三波段激發(fā)片，用于同時(shí)激發(fā) DAPI，Green 和 Orange；三個(gè)單波段激發(fā)片，用于 分別激發(fā) DAPI，Green 和 Orange；

3. 含一個(gè)雙波段激發(fā)片，用于同時(shí)激發(fā) Green 和 Red；一個(gè)三波段激發(fā)片，用于同時(shí)激發(fā) DAPI，Green 和 Red；三個(gè)單波段激發(fā)片，用于分別 激發(fā) DAPI，Green 和 Red。